想選擇合適的二抗就必須會這些常識！ 二抗是指用于靶向結合一抗的抗體。在多種免疫印跡、ELISA以及免疫熒光等免疫實驗中，二抗經(jīng)常和一抗結合使用以檢測目標蛋白。很多二抗都帶有標記物，例如AlexaFluor熒光染料或辣根過氧化物酶（HRP），從而使二抗的信號可以被檢測到。
實驗中也可以使用帶有標記物的一抗，但是二抗有很多優(yōu)點。無論是使用哪種一抗進行檢測，使用二抗可便于更換不同的標記物。例如，同樣的一抗可以與HRP標記二抗一起用于免疫印跡，也可以與另一種AlexaFluor488熒光標記二抗一起用于免疫熒光實驗。
另外，二抗結合在抗原位置的標記染料比直標一抗要多，從而增強檢測信號。使用二抗可以避免對一抗進行復雜且昂貴的化學標記（偶聯(lián)），而且偶聯(lián)反應（具有氨基酸特異性）可能干擾一抗對抗原的識別。
選擇合適的二抗
要選擇出一種適用于您的應用和研究的佳二抗，建議考慮以下因素：
種屬來源和種屬反應性；特異性反應；純化方法；交叉吸附；多重檢測能力；抗體類型和亞型；完整抗體還是抗體片段；標記物；生物素結合蛋白。
01 種屬來源和種屬反應性
種屬（Host）來源是指制備這種二抗的物種。常見種屬來源包括雞、驢、山羊、小鼠、兔、大鼠以及綿羊。因大多數(shù)一抗是在小鼠或兔的體內(nèi)制備的，山羊來源的抗鼠、抗兔IgG二抗是廣泛的商業(yè)化二抗。
注意：所用二抗的種屬來源必須不同于一抗的種屬來源和反應種屬。例如，如果一抗來源于兔，則不能使用來源于兔的二抗。
02 特異性反應
區(qū)別于一抗的特異性概念（一抗只識別目標蛋白），二抗的特異性指針對一抗的反應特異性，其不僅包括特異識別目標物種（一般經(jīng)交叉吸附），還包括特異識別目標免疫球蛋白（Ig）的類型或亞型，以及該二抗是否和抗體的特定部分結合。
常識：如果一抗使用兔多抗，則需要使用抗兔二抗。如果一抗是鼠IgG2b，則二抗需特異識別該亞型。
03 純化方法
動物血清或腹水一般經(jīng)四種常見純化方法：親和純化、特異性純化、層析法、脫鹽法。大多數(shù)Invitrogen二抗經(jīng)過親和純化（protein A或protein G），純化后抗體純度能達到95%以上。特異性純化是將抗原固定后進行純化的方法，可以保證抗體純度和特異性更高，大多數(shù)Invitrogen流式應用的二抗都經(jīng)過此方法純化。
04 交叉吸附（Cross-Adsorbed）
對二抗進行交叉吸附可以幫助去除來源于非目標抗體和蛋白的交叉反應性，從而提高抗體的特異性。交叉吸附是指將親和純化的二抗通過一個固定有其它種屬來源的抗體或血清蛋白的純化柱。能夠識別這些其它種屬來源的抗體或血清蛋白的二抗將結合在純化柱上，通過這種方法可以獲得交叉反應性更低的二抗，從而降低背景和提升抗體效價。
